Классификация микроскопов для медико-биологических исследований

Понятие «парк микроскопов», близко понятию «парк автомобилей»: и тот и другой вид продукции тесно связан с человеком, с его потребностями, психологией, понятием «комфортности» и... консерватизмом. Огромное разнообразие личных желаний и требований профессии, стилей и моды, психологии и логики породили широкий выбор автомобилей и... микроскопов.

Классификация микроскопов неразрывно связана с классификацией объекта, способом его освещения, а также с принципом построения изображения и требованиями комфортности наблюдений (табл. 6.1).

Попробуем разобраться в огромном разнообразии микроскопов, при этом будем рассматривать каждый вид, отмечая его отличительные признаки.

Первый признак: объект исследования.

По этому признаку микроскопы можно разделить на следующие основные виды:

микроскопы плоского поля — это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в двумерном пространстве — двумерное изображение (по координатам Х-У/площадь). Объекты исследования — тонкие, в среднем, толщиной от 10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения (эффекты косого освещения, фазового контраста, дифференциально-интерференционного контраста);

стереоскопические микроскопы — это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмерном пространстве — объемное, трехмерное изображение (по координатам X-Y-Z/объем). Объекты исследования — габаритные, в среднем, толщиной от 100 мм до 1 мм, просматриваемый слой по высоте/глубине — от 50 мм до 0,5 мм. В этих микроскопах можно наблюдать и плоские объекты.

Для удобства работы с объектами или в зависимости от условия их размещения (специальная посуда, термокамера) микроскопы конструктивно могут быть выполнены в двух вариантах:

прямые микроскопы (классическое построение схемы микроскопа) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена сверху объекта. Это относится как к микроскопам плоского поля, так и к стереомикроскопам;

инвертированные микроскопы (перевернутое построение схемы микроскопа) — сконструированы таким образом, что наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена снизу объекта. Этот конструктивный признак относится только к микроскопам плоского поля.

Второй признак: конструкция осветительной системы микроскопа.

В зависимости от способа освещения все рассмотренные выше типы микроскопов можно разделить следующим образом:

микроскопы проходящего света (классические микроскопы для биолого-медицинских исследований), основной принцип освещения в которых связан с тем, что свет проходит через объект. С помощью микроскопов проходящего света плоского поля, которые могут быть как прямыми, так и инвертированными, а также стереоскопическими, можно рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты;

микроскопы отраженного света (металлографические микроскопы), основной принцип освещения в которых связан с тем, что свет падает на объект и отражается от него. На микроскопах отраженного света плоского поля, которые могут быть как прямыми, так и инвертированными, а также стереоскопическими, исследуются объекты непрозрачные, с различной степенью отражающей способности, и полупрозрачные. Существуют два вида микроскопов отраженного света, связанные с освещением объекта с помощью объектива и вне него;

собственно микроскопы отраженного света, в которых свет проходит через оптическую систему микроскопа (в том числе, и объектив, как часть осветительной системы), отражается от объекта, и вновь проходит через оптическую систему микроскопа (объектив, как основной элемент, воспроизводящий увеличенное изображение объекта);

микроскопы падающего света, в которых свет «падает» на объект, минуя оптическую систему микроскопа (объектив), отражается от объекта и проходит через оптическую систему микроскопа (объектив).

В основном микроскопы падающего света — это стереоскопические микроскопы. Правда, иногда в отечественной практике люминесцентные микроскопы плоского поля с осветителем отраженного света относят к микроскопам, работающим в падающем свете. Дело в том, что мы рассматриваем изображение, построенное не совсем тем световым потоком, который прошел через оптическую систему микроскопа от источника света и отразился от объекта. А вторичным, который появился в результате воздействия на объект. Строго говоря, речь идет об одном и том же световом потоке, только объект освещается одной длиной волны, а изображение строится другой.

Обе основные осветительные системы могут быть конструктивно объединены, тогда микроскоп становится микроскопом проходящего и отраженного света. Обычно это исследовательские или универсальные микроскопы.

Третий признак: принцип построения изображения.

В основном, это связано с физико-химическими явлениями, которые возникают при воздействии светового потока на объект или препарат, приготовленный специальным способом. При этом световой поток также может быть подвержен изменению, как по форме, так и по своим физическим свойствам. В таком случае микроскопы можно разделить следующим образом.

Микроскопы светлого поля обеспечивают следующую картину — на светлом фоне более темное изображение объекта.

Основные условия освещения: это обычный прямо проходящий свет, изменения в котором могут быть связаны только с длиной волны светового потока, определяемой применением в осветительной системе широкополосных светофильтров из обычного цветного стекла. Редко используются узкополосные специальные светофильтры (интерференционные).

Классическая схема подобного микроскопа делает его базовым для обеспечения условий получения различных методов контрастирования. Еще лет 25 тому назад (в 70-е годы) можно было увидеть целую гамму специальных микроскопов, которая выглядела следующим образом.

Микроскопы с методом косого освещения обеспечивают следующую картину — на сером фоне можно наблюдать контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того, как попадает на объект.

Микроскопы с методом темного поля (Термин «темнопольный микроскоп») гарантируют такое изображение — на темном фоне можно наблюдать более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объекта.

Основные условия освещения: а) в микроскопах проходящего света — обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект; б) в микроскопах отраженного света — обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива.

Микроскопы с методом фазового контраста (Термин «фазовый микроскоп». Кстати, термин «иммерсионный микроскоп» относился к микроскопу с иммерсионным объективом) (самый популярный микроскоп для биолого-медицинских исследований прозрачных слабоконтрастных объектов) дают возможность с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом контрасте картина обратная.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет перекрывается, но в два этапа — часть света до объекта, а затем после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослаблением. При этом свет в виде светового кольца определенной площади проходит через объект, а затем после объекта — через полупрозрачное кольцо в объективе.

Однако для практической работы не всегда требуются такие узкоспециализированные микроскопы. Тем более что реализация указанных методов контрастирования изображения объекта реализуется достаточно просто и, практически, только в пределах изменений в одном узле — конденсоре. Проще выпускать один конкретный съемный узел или дополнительное устройство (если изменения касаются еще, например и объективов, как в фазовом контрасте). Проблемы стали решаться еще проще, когда появился новый принцип конструирования — модульный, который обеспечивает полную взаимозаменяемость узлов, как кубиков-модулей. Применение различных модулей для методов контрастирования расширяют функциональные возможности базовой модели проходящего или отраженного света, позволяя создавать именно ту модель, которая наилучшим способом удовлетворяет требованиям пользователя.

И все же в парке микроскопов есть место для специализированных микроскопов, которые, несмотря на модульность конструкций, все же имеют собственное название и определяют свою группу. Методы исследования в этих микроскопах реализуются значительно большим количеством узлов и деталей (кроме объективов и конденсоров).

Люминесцентные микроскопы обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов.

Основные условия освещения: обычный прямо падающий свет определенной длины волны попадает на объект, изображение объекта строится в другой длине волны; выделение соответствующих областей спектра происходит с помощью сложной системы блоков интерференционных светофильтров.

Поляризационные микроскопы в общем случае обеспечивают наблюдение на сером или темном фоне разноцветного, четкого или контрастного изображения.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью анализатора происходит выделение из структуры изображения тех элементов, которые связаны с анизотропией объекта. Микроскопы этого типа имеют вариант, который в последнее время формируется на базе микроскопа светлого поля.

Микроскопы дифференциально-интерференционного контраста или интерференционного контраста, обеспечивающие наблюдение на однотонном цветном фоне яркого цветного «объемного» изображения или изображения того же цвета, что и фон, но с окантовкой из другого цвета.

Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью специальной призмы (или другого специального элемента) и анализатора происходит создание объемного (в пределах глубины резкости объектива) цветного контрастного изображения независимо от того, является ли объект анизотропным или нет.

Эта группа микроскопов существует как самостоятельно, так и в виде модуля (дополнительных принадлежностей — специальных призм, которые устанавливаются для объективов и конденсоров) .

Ультрафиолетовые микроскопы и инфракрасные микроскопы — освещение и наблюдение изображения объекта с помощью электронно-оптических преобразователей (ЭОПов) вне видимого спектрального диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.

Рассмотренное разделение в одинаковой степени относится как к микроскопам плоского поля прямым и инвертированным, так и к стереомик-роскопам, а также к микроскопам проходящего и отраженного света.

Четвертый признак: способ наблюдения, документирования и анализа изображения:

Обычные микроскопы, в которых изображение фиксируется и анализируется глазами человека; с помощью дополнительных съемных приспособлений можно выводить изображение на телеэкран и монитор, на фотопленку.

Фотомикроскопы — это сложная фотосистема, она встроена в схему микроскопа (причем не одна, а две-три), работает с помощью полностью автоматизированной системы настройки, в микроскопе может быть осуществлена передача изображения на ТВ-зкран, и может производиться видеозапись.

Анализаторы изображения (аппаратно-програмные комплексы) — это комплекс оборудования, в котором изображение фиксируется, передается с помощью аналоговых или цифровых камер и анализируется в системе компьютера, обрабатывающего изображение по определенной программе.

Микроскопы проекционные, в которых проекция изображения осуществляется непосредственно на специальный большой экран (система обычного наблюдения с помощью окуляров отсутствует), при этом разработки конструкций и технологий изготовления экрана направлены на получение такого разрешения элементов изображения объекта, которое было бы приближено к разрешению обычного микроскопа.

Микроскопы сравнения, оптические системы, в которых обеспечивают объединение в одном поле видения двух изображений, полученных с помощью двух разных микроскопов, при этом два изображения могут накладываться друг на друга или располагаться рядом, занимая какую-либо часть поля.

Микроскопы-спектрофотометры, в которых производится измерение оптической плотности, светопропускания или светоотражения участка объекта в спектральном диапазоне обычно от 300 нм до 700 нм. Это происходит с помощью фотометрических насадок, включающих ФЭУ (фотоэлектрические умножители) и системы диафрагм, ограничивающих фотометрируемый (изучаемый) участок на объекте, а также специального монохроматора, выделяющего необходимую длину волны.

Развитие современной науки, техники и технологии ведет к усовершенствованию световых микроскопов, приближая их по разрешению и созданию изображения к электронным микроскопам. Все чаще встречаются такое словосочетание: лазерный сканирующий микроскоп, конфокальный микроскоп и туннельный микроскоп. В них используется принцип послойного сканирования изображения с различным шагом по глубине и площади с помощью лазерного луча или обычного пучка света минимального (точечного) размера. Шаг сканирования объекта по глубине может составлять доли микрона: чем он меньше, тем точнее воспроизводится объемный рельеф объекта. Оптико-механическая конструкция и электронная схема микроскопов, формирующая сканирующий пучок, достаточно сложные и точные в изготовлении.